背景知识
什么是纳米粒子(Nanoparticles)?
根据国家纳米技术倡议(National Nanotechnology Initiative，NNI)的说法，“纳米技术就是理解和控制大小在1到100纳米(nm)范围内的物质。”因此，纳米粒子(NPs)被定义为大小约在 1至100纳米的颗粒物质(Vert等，2012)。
为什么要使用纳米粒子?
NP的小尺寸和高表面积与体积比使其成为诸如医学成像，药物输送，化妆品，服装，个人护理和过滤等许多领域的新颖应用的理想选择。 目前，伍德罗˙威尔逊国际学者中心和纳米新兴技术项目(PEN)列出了2000多个纳米材料在20多个国家的消费品，其中银，碳，钛，硅，锌和金是产品中最常用的材料 (Vance等，2015)。 例如，银纳米粒子(AgNPs)通常被纳入运动服装中，利用其抗菌特性来抑制气味(Ahamed等，2010)。 二氧化钛纳米粒子和氧化锌纳米粒子因其透明的外观，光滑的应用和广谱的紫外线防护，常被用作防晒剂的主要防紫外线剂(Lewicka et al。2013)。
图1-1 粉底中存在的二氧化钛纳米粒子(TiO2 NPs，亮白色点) 样品：Emily C。SEM成像：Laurent H.，Jesse K.
图1-2 防晒剂中存在的氧化锌纳米粒子(ZnO NPs，亮白色点) 样品：Emily C。SEM成像：Laurent H.，Jesse K.
纳米粒子在使用中有什么问题?
当评估NP对环境或人类健康的潜在风险时，应考虑两个主要因素：接触可能性和毒性。 尽管由于纳米技术的相对新颖性，纳米颗粒的长期效应在很大程度上是未知的，但许多体外和体内研究指出潜在的负面健康和环境影响。
“风险”的第一部分涉及暴露于NP下的可能性。 根据PEN的说法，NPs是“健康和健身”产品中最常用的 - 占记录产品的42%(Vance等，2015)。 这个类别的一些例子包括运动装，防晒霜和化妆品。 例如，AgNP是抗菌运动织物上常见的涂层(Ahamed等2010); 然而，在人造汗液中培养时，已显示其会从织物中释放(Kulthong等，2010)。 这表明AgNPs在运动过程中可能会脱落，很可能使AgNPs与皮肤接触。 在化妆和防晒霜(图1-1和1-2)中常常发现TiO 2和ZnO NPs，它们被局部施用并且与人们长时间接触。 近期的消费品中纳米材料使用量的增加导致了更高的暴露率。
纳米颗粒的小尺寸使它们在消费品中有多种用途，而因其比大型化学品更具反应性，通常毒性更大。 影响毒性的因素有很多，如组成，表面特征和形状，但颗粒的大小似乎对毒性有最直接的影响。 在使用大肠杆菌中测试时，当暴露于10nm以下的微波银颗粒下时，毒性会急剧增加(Ivask等，2014)。 在对甲壳类动物，藻类和原生动物的另一项研究中，CuO纳米粒子显示出比微粒(即0.1微米和100微米之间的粒子)高达5000倍的毒性(Bondarenko等，2013;Vert等，2012)。
了解到纳米粒子的大小与毒性直接相关后，一些研究已经检查了常用的小(<35nm)NPs对环境和健康的影响。 ZnO纳米颗粒可以抑制常见湿地植物的根系生长(Yin et al。2012)。 黑头鲰(Pimephales promelas)胚胎在暴露于不同浓度的AgNPs后会导致死亡或经历生长异常(Laban等，2010)。 此外，体外研究报道了NPs对人类细胞的负面影响。 Paddle-Ledinek等人发现含AgNPs的抗菌伤口敷料对皮肤细胞(角质形成细胞)具有细胞毒性; 作者在两者接触3小时后注意到“无序”的形态学特征并且细胞增殖，生存力和代谢出现降低(2006)。 徐等人也报道了20纳米的AgNPs可能会对神经元发育造成不利影响; 在NPs暴露下降低了早产大鼠神经元的细胞活力并引发了成熟大鼠神经元的变性(2013)。
随着纳米技术成为我们日常生活的一个组成部分，纳米材料及其废物将由于处置方法不足而进入，而且可能已经污染了我们的自然环境。 据估计，在消费品中使用的AgNPs和TiO2纳米颗粒中约有95%会进入废水中(Mueller & Nowack 2008)。 考虑到美国大部分家庭都与公共下水道相连接，Holder等人估计在美国每年有2.7吨AgNPs和229.3吨TiO2进入城市污水处理厂中(2013年)。
目前的解决方案
目前还没有专门规定NPs使用和处置的政府政策，因为世界各地的机构仍然依据现有的大宗化学品准则对其进行管理(Breggin 等，2011)。 然而，最近有研究表明，与大规模化学品相比，NPs的行为有着根本性的不同，且风险显着增加。 在美国，大型化学品生产每年有100公斤的生产门槛，制造商需要通知环保署其活动(美国律师协会2006)。 由于纳米材料作为大宗化学品具有不同的性质，这些过时的法律允许许多公司逃避法规，向顾客出售含有NP的产品而无需监督(Holder等，2013)。
尽管需要防止NP污染，但目前的市政污水处理厂没有专门的程序去除废水中的NP。 相反，纳米颗粒仍在使用传统的处理较大的颗粒的方法来进行处理：使用絮凝剂进行沉降。 虽然这个过程中可以去除一些纳米粒子，但完整的纳米粒子去除尚未实现。 一项对亚利桑那州污水处理厂进行监测的研究发现，尽管沉淀过滤对大型集料(72%的去除率)有效，但大多数小型二氧化钛纳米颗粒(41%去除率)仍然可以通过污水处理厂进入下游的主要水系统中去(Kiser 等，2009)。
在台北迪化的市政污水处理厂也是如此 - 没有针对小型NP的处理流程。 当进行走访时，他们给了台北美国学校iGEM团队一个处理后的将会排放到淡水河中的污水样本。 使用扫描电子显微镜对这个样品进行成像后，发现流出物中含有NPs(图1-3)，表明NPs确实被释放到了台北市居民的主要休闲胜地淡水河。 因此，制定一个有效的，节能的方法去除世界各地的污水处理厂的NPs，对于阻止水体的NP污染，减少公众健康和环境危害至关重要。
图1-3迪化污水处理厂污水在扫描电镜图像 大量聚集的NP(亮白点)表明当地的污水处理厂无法完全去除NPs。 SEM成像：Laurent H.，Jesse K.
纳米粒子去除的合成生物学解决方案
台北美国学校2017年iGEM团队在本项目中的目标是有效地去除废水系统中的NPs以防止NP污染。 然而，这个看似简单的目标却因纳米粒子“形形色色”的多种各类而难以实现。 这意味着利用一类NP的高度特定性质的方法是低效的，因为这些方法对其他类型的NP不起作用。 针对这一点，他们设计了一个双管齐下的方法来最大限度地利用可捕获的NPs类型。
Proteorhodopsin(视紫红质，PR)膜受体
在消费品中发现的或为研究创造的大多数纳米粒子在其表面上具有“涂层”(称为封端剂，capping agents)以防止它们自身聚集。 这使得封端剂在许多不同类型的NPs中成为一个统一的属性。 而柠檬酸盐是工业中最常用的封端剂(Levard等，2012)，在海洋变形杆菌中发现的称为Proteorhodopsin(PR)的膜蛋白能够结合柠檬酸盐。 项目的目标是在大肠杆菌的膜上表达PR以结合并保持在柠檬酸盐封端的NP(CC-NP)上。 理想情况下，表达PR的大肠杆菌将能够与CC-NPs结合，与污水处理过程中使用的许多其他微生物一样，其尺寸和重量将会增加，使得污水处理厂中的现有基础设施可以在NPs释放进入天然水体之前将其过滤掉。
PR是在变形菌中发现的跨膜蛋白。 由于PR先前已经显示出通过其表面上的两个带正电荷的赖氨酸残基结合柠檬酸盐的能力 (图2-1;Béjà等2000; Syed 2011)，因此推测PR也可以结合CC-NPs的柠檬酸盐封端剂。
图2-1 PR-柠檬酸盐相互作用(Syed 2011)。 PR表面的两个赖氨酸残基(蓝色)可以结合柠檬酸盐(红色)。
首先获取pR(Syed 2011)的DNA序列，并对其进行了修改以去除三个内部切割位点(EcoRI，PstI和SpeI)。 然后，pR的序列的上游连接一个强启动子和强核糖体结合位点(RBS)的组合(BBa_K880005)，并在其下游加入双终止子(BBa_B0015)以最大化PR蛋白的表达。 该最终构建体(BBa_K2229400;图2-2)从IDT订购并克隆到生物砖主链(BBa_K2229400;图2-4)的pSB1C3中。设计PCR引物以分离pR开放阅读框(ORF)，然后将其克隆到pSB1C3(BBa_K2229450;图2-3和2-5)中。
图2-2 BBa_K2229400：Proteorhodopsin表达。构建包括强启动子，强RBS，pR ORF和双终止子。 图：Justin Y.
图2-3 BBa_K2229450：分离pR ORF并将其克隆到pSB1C3中。 图：Justin Y.
粘性生物膜
如果NPs不是由柠檬酸盐封端的怎么办 ?为了捕捉更多种类的NP，无论封端还是不封端的，台北美国学校2017年iGEM团队采用了一种不针对任何NP的具体特征的一般方法。 他们最初受到了使用水母粘液在短时间混合后捕获并从水中取出金纳米粒子的研究的启发。 然而，由于很少有会对这种新用途的研究，难以找到水母粘液的基因序列数据。
之后的工作很快转向另一种由许多细菌自然产生的粘性物质：生物膜中的胞外聚合物(EPS)。生物膜是由细胞外聚合物(EPS)组成的微生物群落，它由不同的多糖，蛋白质和脂质组成(Donlan 2002)。 最近的研究表明生物膜中的EPS也可以捕获各种NPs(Kaoru等，2015，Nevius等，2012;图3-1)，并将其从溶液中拉出，类似于水母粘液(Patwa 等，2015)。
大多数污水处理厂(WWTPs)已经在利用微生物分解和清除废水中的有机成分(Sehar & Naz 2016)。最近越来越多的NP污染物进入污水处理厂对这些微生物和处理过程构成了威胁。 例如，AgNPs具有抗菌作用，其它金属氧化物NPs可以抑制微生物进行硝化等重要过程(Yun & Lee 2017;Walden & Zhang 2016)。 与浮游细菌相比，生物膜几乎是NPs的四倍，增加了它们对NPs在废水中的耐受性(Choi等，2010)。
大肠杆菌通过两个curli操纵子产生生物膜，可以通过OmpR和CsgD两种蛋白来调节。 还有许多调控大肠杆菌生物膜合成的其他调控机制，但是由于生物膜形成通常与诸如尿路感染(UTI)等疾病相关，所以要避免涉及与毒力相关的基因(Fattahi等，2015)。 项目团队还选择使用一种安全和普通的实验室菌株-E。 大肠杆菌K-12-作为基因电路实施的底盘(环境保护机构1977)。 目标是通过组成型过度表达OmpR和CsgD来增加普通实验室菌株大肠杆菌K-12中的生物膜产量。
图3-1使用大肠杆菌生物膜(绿色)来捕获不同大小和成分(粉红色)的纳米粒子。
在大肠杆菌中，生物膜合成主要通过两个curl操纵子介导(Barnhart & Chapman 2006)。 Curli纤维促进细胞表面和细胞 - 细胞粘附，生物膜合成，并且是EPS的主要蛋白质组分(Reichhardt等，2015，Barnhart & Chapman 2006)。 操纵子(csgBA和csgDEFG)控制生物膜形成所必需的六种蛋白质的表达(图3-1)。 CsgA和CsgB是可以聚合形成卷曲纤维的卷曲单体;CsgD是csgBA转录的激活剂(图3-1)。 CsgE，CsgF和CsgG帮助将CsgA和CsgB导出到细胞外。 操纵子csgDEFG可被OmpR蛋白激活，随后所有六种蛋白质的表达增加生物膜的形成(Barnhart & Chapman 2006)。
图3-1两个curli操纵子：csgBA和csgDEFG——直接生物膜合成。 图：Justin Y.
通过过表达CsgD，OmpR234(组成性活性的OmpR的突变形式)或两者来构建三种构建体以上调curli产量。 项目团队从iGEM分发试剂盒中获得所有所需部件：强启动子和强RBS组合(BBa_K880005)以最大化蛋白质生产，强RBS(BBa_B0034)，csgD(BBa_K805015)，ompR234(BBa_K342003)和双终止子(BBa_B0015) 转录。
图3-2 BBa_K2229100：CsgD的表达，构建包括强启动子，强RBS，csgD和双终止子。 图：Justin Y.
图3-3 BBa_K2229200：OmpR234的表达，构建包括强启动子，强RBS，ompR234和双终止子。 图：Justin Y.
为了最好的表达CsgD和OmpR234(图3-4，BBa_K2229300)，在中间体BBa_S05398(ompR234双重终止子)前面插入强RBS(BBa_B0034)以制造BBa_S05399(RBS+ompR234+双终止子)。 最后，在BBa_S05399之前插入BBa_S05397(K880005+csgD)以完成完整的构建体组装(BBa_K2229300)(图3-4)。
图3-4 BBa_K2229300：CsgD和OmpR234的表达，构建包括强启动子，两个强RBS，csgD，ompR234和双终止子。 图：Justin Y.
假设如果过表达CsgD，OmpR234或两者(图3-5)，则生物膜产量会上调(按递增顺序)。 CsgD的过表达会导致更多的单体，但是没有转运蛋白将这些单体携带出细胞。 OmpR234的过表达将允许卷曲单体被输出并形成卷曲纤维和生物膜。 最后，当CsgD和OmpR234过表达时，应制备两倍量的单体，并输出以形成更多的卷曲纤维和生物膜。
图3-5 CsgD和/或OmpR234的过表达不同程度地上调curli操纵子。如果过度表达A)CsgD，B)OmpR234或C)两者，生物膜产量会上调(按递增顺序)。 图：Justin Y.
项目展望
本项目的应用目的是去除工业和生活污水中的纳米粒(NP)子。因为随着近年来多种新兴纳米材料的使用普及，NPs在污水中的含量在逐年增加。而虽然NPs具有多种用途，但是脱落的NPs释放到环境当中会给人身健康和生态环境带来潜在的威胁。项目团队同时使用了两种策略，一种是通过识别NPs的封端剂柠檬酸盐在捕获NPs，另一种是通过生物膜在捕获NPs。虽然是高中队伍，但是台北美国学校iGEM出色证明了他们在项目中设计策略的可行性，为未来有效的去除污水中的NPs提供了可行的方案。
原标题：去除污水中的纳米粒子-台北美国学校2017 iGEM项目简介
